公共事务-农产品总酚的测定（以番茄为例）

1 绪论

总酚的测定

• 标准曲线的绘制

称取没食子酸标准品100.0 mg，用蒸馏水溶解并定容至100 mL，配制成1 mg/mL的储备液。将该储备液逐级稀释，得到浓度分别为0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL的标准系列溶液，备用。分别吸取上述各浓度没食子酸溶液0.6 mL于10 mL比色管中，再依次加入3 mL稀释2倍的福林-酚试剂和2.4 mL 7.5%碳酸钠溶液，充分振荡混匀后，于避光处静置30 min。以蒸馏水为空白调零，在765 nm波长处测定吸光度。以各比色管中没食子酸的浓度为横坐标，相应的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，并得到线性方程。

• 样品的测定

可将待测液适当稀释，使其吸光度落在标准曲线的线性范围内。准确吸取稀释后的待测液0.6 mL于10 mL比色管中，依次加入3 mL稀释2倍的福林-酚试剂和2.4 mL 7.5%碳酸钠溶液，充分振摇混匀，于避光处静置30 min后，在765 nm波长处测定吸光度。将测得的吸光度值代入线性回归方程，即可计算出待测液中没食子酸的含量。

• 计算 $M=\frac{CVn}{m}*100$

式中：

• M：样品中含有的没食子酸当量（总酚含量），mg/100g
• C：代入方程计算得到测定液中的没食子酸浓度，mg/mL
• V：提取液总体积，mL
• n：样液稀释倍数
• m：样品质量，g

2 试剂、耗材的准备

2.1 需要准备的试剂

• 【2.1.1】7.5%浓度的碳酸钠溶液（制备方法参见2.2.1）
• 【2.1.2】1mg/mL浓度的没食子酸溶液（制备方法参见2.2.2）
• 【2.1.3】稀释2倍的福林酚试剂（制备方法参见2.2.3）
• 【2.1.4】75%乙醇

2.2 试剂的制备

【2.2.1】7.5%浓度的碳酸钠溶液的制备（以配制100mL为例）：

1. 使用【电子天平】准确称量【无水碳酸钠】药体【7.5g】；
2. 倒入【烧杯】，接取约80mL的【蒸馏水】；
3. 搅拌使其充分溶解，然后转移到【容量瓶】中；
4. 用少量蒸馏水冲洗搅拌用的【玻璃棒】，水冲到【烧杯】中，然后转移到【容量瓶】中
5. 往容量瓶中加入蒸馏水，直到刻度线达到100mL。

【2.2.2】1mg/mL浓度的没食子酸溶液：

1. 使用【电子天平】准确称量【没食子酸】药体【100mg(0.1g)】；
2. 倒入【烧杯】，接取约80mL的【蒸馏水】；
3. 搅拌使其充分溶解，然后转移到【容量瓶】中；
4. 用少量蒸馏水冲洗搅拌用的【玻璃棒】，水冲到【烧杯】中，然后转移到【容量瓶】中。
5. 往容量瓶中加入蒸馏水，直到刻度线达到100mL。

【2.2.3】稀释2倍的福林酚试剂的制备

1. 倒取10mL福林酚试剂至烧杯
2. 加入10mL蒸馏水
3. 充分震荡混合

2.3 耗材的准备

• 【2.3.1】试管架
• 【2.3.2】移液枪（200-1000微升量程、1ml-10ml量程）、移液枪头若干
• 【2.3.3】容量瓶 * 3
• 【2.3.4】试管 * 5、离心管 * 5
• 【2.3.5】烧杯 *3
• 【2.3.6】紫外分光光度计（含比色管）

3 实验过程

3.1 准备5根试管，制备好的【7.5%浓度碳酸钠溶液】，【1mg/mL浓度的没食子酸溶液】，【稀释2倍的福林酚溶液】，移液枪。大概的材料准备如图1所示。

3.2 将5根试管标定为0.02,0.04,0.06,0.08,0.1mg/mL，使用【200-1000微升移液枪】吸取【1mg/mL没食子酸溶液】相应容量加入到对应的试管中；然后用【1-10毫升移液枪】加入对应量蒸馏水。具体配方参见 表1。此时获得【没食子酸溶液】。

3.3 振荡试管，使没食子酸和蒸馏水充分混合。

3.4 再次准备5根试管，作为比色准备。

3.5 使用【200-1000微升移液枪】调至【600】，将5根试管中的【稀释没食子酸】溶液各吸取600微升，分别加到对应的新试管中。

3.6 使用【1-10毫升移液枪】调至【3.00】，吸取3毫升的【稀释2倍福林酚】到5根新试管中。

3.7 使用【1-10毫升移液枪】调至【2.40】，吸取2.4毫升的【7.5%浓度的碳酸钠溶液】到5根新试管中，参见图2。

3.8 避光静置30分钟，30分钟后的结果如图3所示。

3.9 将5根试管移至【紫外分光光度计】处，准备进行吸光度的测定。

3.10 找到【紫外分光光度计】的【比色管】，加入蒸馏水，准备调零:以【北京普析通用仪器有限责任公司】的T6系列紫外可见分光光度计为例进行设置：按【SET】设置光度方式：光度测量，按ENTER，光度方式按ENTER直到显示【Abs】，然后按【GOTO】键，输入765，按【ENTER】完成波长的设置。参考图4a。之后，在比色管中加入蒸馏水（仔细添加以不要出现气泡），磨砂玻璃面不要对着光度计探头！进行蒸馏水的调零。

3.11 测定完成后，获得实验数据，如图5a-图5e所示。

4 标准曲线的绘制

4.1 使用Origin(R)或Excel(TM)软件进行绘制：以没食子酸浓度为X轴，紫外分光光度计测定数值为Y轴，录入表格，数据来源如图5所示，以Origin为例的数据格式如图6所示。

4.2 生成折线图并进行拟合，令R^2值>0.99可以视同有效值。如图7所示。

5 番茄样品总酚的测定

5.1 从 -80°C 取出一个时间点样本，立刻放冰上；半解冻到能切割或研磨即可。

5.2 称取 5.00 g 番茄组织，记录实际称样量 m。每个时间点都尽量称 5.00 g。

5.3 加入 25.0 mL 80%乙醇，充分匀浆或研磨；避光振荡或超声 30 min。

5.4 离心机8000 rpm 离心 10 min，优先设置 4°C；取上清液到干净容器，参考图如图8所示。

5.5（可选） 残渣再加入 20.0 mL 80%乙醇，重复提取、离心一次。

5.6 合并两次上清，用 纯水定容至 50.0 mL，得到番茄总酚提取液。

默认计算参数：m = 5.00 g，V = 50.0 mL。若实际称样量或定容体积不同，用实际值计算。

5.7 每个时间点的提取液先做原液、2倍稀释、5倍稀释预试。

5.8 按标准曲线同样体系显色，测 765 nm 吸光度。

5.9 选择吸光度落在标准曲线范围内的稀释倍数n；正式测定时固定使用该 n。

5.10 每个样品至少做 2-3 个平行管，记录 A1、A2、A3 和平均吸光度。

5.11 若吸光度高于最高标准，继续稀释；若低于最低标准，优先使用原液并在记录中说明。